第423章成功

庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因。相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用。使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。常用的一种报告基因是β-d-葡萄糖苷酶基因，该酶催化底物形成β-d-葡萄糖苷酸。它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。荧光酶基因(luc)是1985年从北美荧火虫和叩头虫cdna文库中克隆出来的。该酶在有atp、mg2+、o2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用转基因植物整株或部分直接用x-光片或专门仪器进行检测。

    在动物基因表达调控的研究中。报告基因也被广泛应用。常用的有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-半乳糖苷酶基因(lacz)、二氢叶酸还原酶基因、荧光酶基因等。cat基因作为报告基因，检测时可通过放射自显影观察。荧光酶基因作为报告基因，具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30~1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。

    可通过报告基因的表达，研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用。双杂交体系是由报告基因转录调控区、报告基因及一对可以相互作用的杂合反式作用因子组成。来从上述杂交体系中发展出的单一杂交体系技术，也是根据报告基因表达量的检测筛选出与已知顺式作用元件相结合的未知因子的dna，该项技术正广泛应用于克隆细胞中含量微弱且用生化手段难以纯化的反式作用因子。

    由此可知，报告基因在基因表达调控和基因工程研究中处于非常重要的地位。它是作为外源目的基因能否转化植物体的探路先锋而首先被研究的，在研究植物的基因表达调控方面起着重要的作用，现已推广到真核生物的基因调控领域中。随着基因工程技术日新月异的发展，报告基因这一探路者的作用会更明显。

    最常用的报告基因大多是编码抗生素抗性蛋白的基因，通过检查产物是否具有抗生素的抗性来确定基因的表达情况。

    氯霉素乙酰基转移酶(cat):该报告基因来源于大肠杆菌转位子9，是第1个用于检测细胞内转录活性的报告基因。氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰coa的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素解毒。cat在哺乳细胞无内源性表达，性质稳定，半衰期较短，适于瞬时表达研究。可用同位素、荧光素和酶联免疫吸附测定检测其活性。也可进行蛋白质印迹)和免疫组织化学分析。cat与其他报告基因相比，线性范围较窄，灵敏性较低。

    β半乳糖苷酶:β半乳糖苷酶由大肠杆菌lacz基因编码。可催化半乳糖苷水解。最大优势是易于用免疫组织化学法观测其原位表达，是最常用的监测转染率的报道基因之一。以邻-硝基苯-β-d-半乳吡喃糖苷(onpg)为底物可用标准的比色法检测酶活性，其检测动力学范围为6个数量级。氯酚红-β-d-半乳吡喃糖苷(cprg)是另一个可用比色法检测酶活性的底物，其灵敏度比onpg高近10倍。以mug和荧光素二半乳糖苷(fdg)为底物则可用荧光法检测其活性。此法可检测单个细胞的酶活性，并可用于流式细胞学(facs)分析。如以二氧杂环丁烷为底物，可用化学发光法检测酶活性，其检测动力学范围最大，灵敏度最高，与用生物发光法检测荧光素酶活性的灵敏度相似。

    荧光素酶是能够催化不同底物氧化发光的一类酶。哺乳细胞无内源性荧光素酶。最常用的荧光素酶有细菌荧光素酶、萤火虫荧光素酶和renilla荧光素酶。细菌荧光素酶对热敏感，因此在哺乳细胞的应用中受到限制。萤火虫荧光素酶灵敏度高。检测线性范围宽达7~8个数量级，是最常用于哺乳细胞的报道基因。用荧光比色计即可检测酶活性，因而适用于高通量筛选。随着具有膜通透性和光裂解作用的萤火虫荧光素酶的应用，无需裂解细胞即可检测酶活性。renilla荧光素酶催化肠腔素氧化，产物可透过生物膜，可能是最适用于活细胞的报告分子。将荧光素酶报告基因载体转染到细胞中，可用荧光素酶检测系统灵敏方便地测定荧光素酶基因的表达。自1986年起，萤火虫荧光素酶基因被用作测定基因表达的报告基因，获得了广泛的应用ga公司的pgl3及pgl2系列载体，含sv40启动子及增强子的不同组合，有助于分析dna片段的转录活性。

    “主人，成功了！”

    不知道过了多久，墨莲人恭敬地对李安道。

    李安满意地看着自己的身体，然后进入了这个躯体之中！(未完待续)